پاسخ به:بانک مقالات زیست شناسی
یک شنبه 31 اردیبهشت 1391 2:15 PM
| 2 : زيست شناسي ايران پاییز 1385; 19(3):251-263. |
| تخليص يوبي كوييتين و توليد آنتي بادي اختصاصي عليه يوبي كوييتين |
| حجت مهشيد,شباني اشرف,طالبيان اصغر,آخوندي محمدمهدي,قدس رويا,صادقي محمدرضا |
|
روشهاي ايمونوشيمي مانند الايزا، راديو ايمونواسي و ايمونوفلورسانس، روشهايي حساس و سريع جهت آناليز يوبي كوييتين و ساير مولكولهاي زيستي، بر پايه استفاده از آنتي بادي اختصاصي بعنوان شناساگر مي باشند. لذا تهيه آنتي بادي اختصاصي عليه يوبي كوييتين همواره يكي از ابزارهاي مهم در بررسي و رديابي اين پروتيين است. هدف از اين تحقيق تخليص يوبي كوييتين از گلبولهاي قرمز انسان و توليد آنتي بادي اختصاصي عليه آن وكونژوگاسيون آنتي بادي به منظور استفاده در مطالعات ايمونوشيمي مي باشد. در اين تحقيق ابتدا يوبي كوييتين از گلبولهاي قرمز خوني با دناتوراسيون حرارتي و يا بوسيله سولفات آمونيوم جدا و نهايتا با كروماتوگرافي بر روي ژل DEAE-Sephadex تخليص گرديد. اين پروتيين بكمك گلوتارآلدييد به پلي يوبي كوييتين تبديل و بعنوان ايمونوژن در دوزهاي مناسب به خرگوش تزريق گرديد. پس از تعيين تيتر آنتي بادي در سرم خرگوشي با روش الايزا و خونگيري در حجم مناسب، جداسازي آنتي باديهاي سرم خرگوشي، از روش ايمونوافينيتي بر روي ستون كروماتوگرافي جذبي فعال شده با پروتيين A، انجام شد. سپس با اتصال يوبي كوييتين به عنوان ليگاند به ژل CNBr activated sepharose-4Bو عبور آنتي باديهاي خرگوشي مرحله قبل از ستون كروماتوگرافي جذبي متصل به يوبي كوييتين، آنتي بادي اختصاصي عليه يوبي كوييتين خالص شد. سپس آنتي باديهاي اختصاصي، با ماده فلورسانس فلورسيين ايزوتيوسيانات كونژوگه و در پايان جهت تائيد قابليت آنتي باديهاي مذکور در شناسايي و اتصال به اپي توپهاي پروتيين يوبي کوييتين، تستي به روش ايمونوفلورسانس طراحي شد. نتايج انجام SDS-PAGE برروي يوبي كوييتين تخليص شده از ستون تعويض يوني و آنتي باديهاي سرمي تهيه شده از ستون جذبي، به صورت تك باند بر روي ژل ظاهر گرديد.همچنين بكمك تست الايزا، ويژگي آنتي باديهاي اختصاصي تخليص شده به پروتيين يوبي كوييتين تائيد گرديد . در هر بار تخليص1 mg يوبي كوييتين به ازاي 100 ml گلبول قرمز و 0.6 mg آنتي بادي اختصاصي عليه يوبي كوييتين، به ازاي 8 ml سرم ايمن شده خرگوش حاصل گرديد. در بررسي ايمونوفلورسانس اسپرمهاي پوشيده از يوبي کوييتين با توجه به اينكه يوبي كوييتين محور بسياري از تحقيقات زيستي است به کمک آنتي باديهاي کونژوگه با فلورسيين ايزوتيوسيانات، فلورسانس قابل توجهي در مقايسه با کنترل منفي آزمايش مشاهده گرديد لذا تهيه اين ماده و آنتي بادي عليه آن، و همچنين كونژوگه كردن اين آنتي بادي با ملكولهاي فلوركروم امكان بررسي بيشتر عملكرد آن را فراهم مي سازد. |
| كليد واژه: |
 |
|
نسخه قابل چاپ |
