پاسخ به:بانک مقالات زیست شناسی
یک شنبه 31 اردیبهشت 1391 9:59 AM
3 : زيست شناسي ايران 1390; 24(1):25-34. |
توليد آنتي بادي اختصاصي پروتئين PGIP1 بيان شده به صورت هترولوگ در باکتري و استفاده از آن جهت تاييد بيان PGIP در گياهان کلزاي تراريخت |
مقدسي جهرمي زهرا,زماني محمدرضا*,مطلبي مصطفي,اخگري اميربهزاد,فلاحي فهيمه |
* پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري، تهران |
قارچهاي بيماريزاي کلزا که سالانه خسارت زيادي را به اين محصول وارد مي کنند براي نفوذ در گياه، با ترشح آنزيمهايي باعث تجزيه مولکولهاي ديواره سلولي آنها مي شوند. در طي تکامل در گياهان، پروتئينهايي براي مهار اين آنزيمها بوجود آمده است. PGIP1 از جمله اين پروتئينها بوده که قدرت نفوذ قارچ در گياه را مهار مي نمايد. در اين تحقيق با توجه به اينکه آنتي بادي عليه پروتئين PGIP1 لوبيا به صورت تجاري موجود نمي باشد و از طرفي جهت تاييد بيان PGIP1 در گياهان کلزاي تراريخت بدست آمده نياز به آنتي بادي مربوطه مي باشد، لذا اقدام به توليد پروتئين PGIP1 در سيستم پروکاريوتي و استفاده از آن جهت توليد آنتي بادي عليه آن گرديد. بدين منظور ژن کد کننده PGIP1 کلون شده در pUC19 بوسيله آغازگرهاي اختصاصي RB وRB2H (به ترتيب حاوي سايتهاي Nde1 و Xho1) تکثير و پس از هضم با اين دو آنزيم در ناقل pET26b (+) کلون گرديد. پلاسميد حاصله پس از تاييدهاي مولکولي به ميزبان بياني E. coli BL21 (DE3) pLysS منتقل گرديد. جهت بهينه سازي شرايط بيان ژن مورد نظر، شرايط مختلفي شامل، غلظتهاي متفاوت IPTG، دماهاي متفاوت کشت و OD زمان القا در کلونيهاي متفاوت مورد بررسي قرار گرفت و نهايتا OD=0.3، دماي 37 درجه سانتي گراد وIPTG=0.5mM بعنوان بهترين شرايط بياني معرفي گرديد. از آنجا که توالي هيستيدين در انتهاي پروتئين کد شده وجود دارد، جهت تاييد بيان پروتئين PGIP1 توسط آزمون وسترن بلات از آنتي بادي Anti-His استفاده گرديد. پروتئين خالص شده در شش نوبت به دو خرگوش تزريق شد. جهت بررسي ميزان تيتر آنتي بادي از آزمون الايزا استفاده گرديد. از آنتي بادي توليد شده جهت تاييد بيان پروتئين PGIP1 توليد شده در گياهان کلزاي تراريخت استفاده گرديد. نتايج حاصل از آزمون وسترن بلات وجود پروتئين مورد نظر را در پروتئينهاي استخراج شده از برگ گياهان کلزاي تراريخت در مقايسه با کلزاي غير تراريخت تاييد نمود. |
كليد واژه: گياه کلزا، آنتي بادي، پروتئنهاي مهار کننده فعاليت آنزيم پلي گالاکتوروناز، گياه تراريخت |
نسخه قابل چاپ |