ماهیان ترانس ژنیک

اصلاح نژاد موجودات، تولید محصولی از موجود با دست بردن در ژن ها از نظر مطلوب کردن صفات بطور دلخواه می باشد و در واقع محور اصلی اصلاح نژاد، بهگزینی است. بسیاری از DNA های هورمون رشد و دیگر ژن های پستانداران، مرغ و خود ماهی بمنظور تسریع رشد به داخل تخم های ماهی منتقل می شوند. با وجود این،نتیجه این انتقال به میزان زیادی به عملکرد درست عناصر تنظیم کننده بستگی دارد. البته این ژنها برای انتقال به هر گونه ای ممکن است مطلوب نباشند بدلیل:
1) عملکرد اختصاصی بافت غیر مطلوب
2) اثرات جانبی که منجر به مختل کردن دیگر عملکردها می شود.

تعریف ماهی ترانس ژن(اصلاح نژاد شده):
این ماهی که دارای یک یا بیشتر از یک ژن خارجی می شود. ژنهای خارجی بطور انتخابی با تزریق میکروسکوپی در داخل تخم وارد می شوند. این پروژه در علم مهندسی ژنتیک در سال 1970 و همچنین 1980 انجام گرفت. ممکن است تزریق میکروسکوپی چنین ژنهایی در داخل تخم حیوانات تولید موجودات ترانس ژن را کند. این تکنیک بعدا برای ماهی بکار برده شد و تعداد بسیار زیادی از ماهیان ترانس ژن در سال 1989 تولید گردید مثل:
الف) ماهی سالمون اقیانوس اطلس که به آن، ژن پروتیین ضد انجماد از ماهی فلاندر قطب تزریق گردیده که این کار بمنظور مقاومت در برابر دماهای پایین آب های قطب در سالمون انجام گردید بطوری که زیستگاه این سالمون می تواند تا آبهای قطبی هم کشیده شود و در نتیجه به سرما خیلی مقاوم تر شده اند.

ب) ماهیان خوراکی قزل آلا، تیلاپیا و گربه ماهی و ... که ژن هورمون رشد را از انسان، موش و دیگر پستانداران دریافت کرده اند که اصلاح نژاد بمنظور تولید گسترده این ماهیان صورت گرفت.

ج)همچنین می توان ژن مقاومت به بیماری و ژن مقاومت محیطی مثل متالوتیونین(که با فلزات سنگین باند می شود و از اثر سمی و بیماریزای آنها جلوگیری می کند) که اگر به ماهی منتقل شوند ماهی ها را در برابر فلزات سنگین حاصله از فاضلاب کارخانجات و یا نفت کش ها و ... مقاوم می کند .

اما در کل ماهی برای عمل ترانس ژنی شدن دارای مشکلاتی می باشند:
1) لایه کوریونی تخم آنها ضخیم و چند لایه است پس تزریق میکروسکوپی درآنها مشکل است و بایستی تزریق از راه دهانه میکروپیلی تخم صورت پذیرد.
2) دیگر اینکه تخم ماهی پر زرده است و ممکن است ژنها قبل از رسیدن به ژنوم هضم شوند که برای تولید انبوه مناسب نیست چون به تک تک تخم ها بایستی تزریق شود.
3) روش دیگر که نفوذ الکتریکی یا Electroporation است که تخم های لقاح یافته را داخل حمام گذاشته و با پالس های الکتریکی یک تعداد ژن وارد تخم ها می شود حسن این کار این است که انتقال ژن بطور انبوه است ولی موفقیت در آن محدودیت دارد.

ژن ها و ماهیان ترانس ژنیک(اصلاح نژاد شده):
Zhu اولین کسی بود که ژن انسولین انسانی را به تخم های ماهی کپور کاراس و سگ ماهی تزریق کرد. ژن هورمون رشد انسانی اولین ژنی بود که با موفقیت بمنظور تولید چنین موجودات ترانس ژنی استفاده گردید.
ژنهای هورمون رشد قزل آلای رنگین کمان و ماهی آزاد پس از سال 1986 در دسترس قرار گرفت که موفقیت با هورمون پستانداران فقط 50 درصد بود بنابراین نیاز فوری برای ساختن ترانس ژنی از این ماهیان وجود دارد.
تکنولوژی ماهیان ترانس ژن بمنظور افزایش میزان رشد ماهیان خوراکی و مقاومت در برابر انجماد در ماهی Zebra fish و medaka استفاده گردید.

اما در آسیا با توجه به بحران های صورت گرفته، تولید ماهی مقاوم به خشکی و بیماری نیاز ضروری و اصلی است و می بایست در این زمینه بررسی های لازم صورت گیرد.


در زیر مزایا و معایب استفاده از تخم ماهی بعنوان مدل دستکاری آمده است:
- مزایا:
لقاح خارجی و مصنوعی، امکان اختلاط تخمک و اسپرم، رسیدگی گامت ها بطور مصنوعی که امکان پذیر است. تخم ها بزرگ و گوناگون بوده و به آسانی بعد از لقاح نگاهداری شده و حداکثر تنوع را دارا بوده و توسعه جنینی سریعتری را دارا می باشند.
تخم های ماهی قابلیت تاه خوردگی کروموزوم های جنسی را دارا بوده از این رو امکان تولید صدها کلونی از یک والد فراهم می گردد.

- معایب:
در بسیاری از گونه ها هسته های زایگوت ها خیلی کوچک است و قابل مشاهده نیست از اینرو تزریق میکروسکوپی نوکلئوپلاسم در داخل هسته های اووسیت از ماهی تخمگذار و زنده زا تنها در تعدادی گونه ها ممکن می گردد. هسته های اووسیت بیشتر از 1000 بار بزرگتر از پستانداران است و پوشش کوریونی تخم خیلی محکم و مقاوم است.

دستکاری ژنی:
برای این منظور تکنیک های دستی و فیزیکی بکار می رود چنین تکنیک هائی نیاز به سوزن های ریزی با کمتر از 1/ 0 میکرومتر ضخامت و پیپت های کوچک و نیز نگهدارنده پیپت بمنظور تزریق میکروسکوپی درست نیاز است و تزریق میکروسکوپی از ژن هورمون رشد گاو و موش در تخم ماهی تیلاپیا با موفقیت انجام شده است. تخم ماهی تیلاپیا بسیار مات است و کوریون سختی دارد از این رو کار در آن حتی با سوزن خیلی کوچک مشکل است بنابراین DNA بیگانه بداخل دیسک ژرمینال از میان میکروپیل قبل از شروع تقسیم سلولی با یک دستکارنده کوچک تزریق می گردد.همچنین تزریق میکروسکوپی ژن هورمون رشد در تخم ماهیZebra fish بوسیله تزریق در داخل سیتوپلاسم قبل از اولین تقسیم با موفقیت انجام گردید.
در ماهیان کوشش های اولیه در زمینه اصلاح نژاد در گلد فیش ها و سگ ماهی ، تیلاپیا، قزل آلا و ماهی آزاد و Zebra fish صورت گرفت و این دستکاری های ژنی، افق جدیدی از آبزی پروری را در گذر زمان در تحقیقات در زمینه سرمایه گذاری ژنی فراهم می سازد.

روش های انتقال ژنی و مزایا و معایب آن:
- تزریق میکروسکوپی:
مزایا:
تزریق دقیق در جایگاه مطلوب در تخم مانند هسته.
سیتوپلاسم که اجازه برآورد کمی از ژن تزریقی را می دهد.


معایب:
زمان بر، نیاز به مهارت،ایجاد تغییر بدلیل صدمه و آسیب سوزن تزریق.

- نفوذ الکتریکی:
مزایا:
به محرک ها اجازه می دهد که به DNA خارجی وارد شده و تولید ماهی ترانس ژن می کند که روش بسیار مناسبی در برخی گونه های ماهی است که تخم های آنها برای تزریق میکروسکوپی بسیار کوچکند.

معایب:
مشکل، ارزیابی کمیت واقعی ژن بیگانه یا خارجی است که به سلول ها وارد می گردد و همچنین سبب مرگ ومیر نسبتا بالا می گردد.

- انتقال اسپرم واسط:
مزایا:
فقدان آکروزوم در اسپرم ماهی که یک میدان عمل وسیع تر را برای انتقال اسپرم واسط فراهم می آورد.

معایب:
فوائد آن بیشتر در پرندگان است اما در ماهی و پستانداران هنوز جای بررسی دارد.


اما استفاده از ترانس ژنها با انتخاب صفات مطلوب به تولید ماهی مطلوب نر و ماده کمک می کند. چینی ها سگ ماهی بزرگی مشابه موش با استفاده از تزریق میکروسکوپی ژن هورمون رشد انسانی تولید کرده اند که نشان می دهد این روش ها در صورت بکاربرده شدن در شیلات کاربرد زیادی در پرورش ماهی دارد.
اما آنچه که در اصلاح نژاد ماهی حائز اهمیت است بطور خلاصه عبارتند از:
- رشد سریع تر
- طول عمر بیشتر
- تغذیه نسبتا همه چیز خواری
- همآوری بالاتر
- سازگاری بییشتر
- با دوام تر و بسیار مقاوم به بیماری، آفت کش ها و آلاینده ها
- از دست دادن استخوان ماهی و دیگر ساختارهای نامطلوب و ....

که برای رسیدن به این صفات مطلوب از دید شیلاتی کار اصلاح نژاد انجام می گیرد
انجماد اسپرم ، کاربرد و روش انجام آن در ماهیان

در زمینه انجماد گامت ها و جنین های موجودات آبزی کار نسبتا کمتری در مقایسه با جانوران و گیاهان خشکی زی انجام شده است. با اینکه اسپرم با موفقیت در برخی از ماهیان انجماد یافته با این وجود کاربرد آن در مزارع خیلی محدود می باشد. اما موفقیت کمی در زمینه انجماد لاروها و جنین ها در صدفها بدست آمده است. همچنین انجماد تخمک و جنین ماهیان زیاد موفق نبوده است زیرا تخمک و جنین ماهیان نسبتا بزرگ است و میزان زیادی زرده دارد که با لایه کوریونی نسبتا ضخیم پوشیده شده است و سرد کردن در طول فرایند انجماد در گونه های بزرگ و متراکم حاصل نمی شود اما انجماد در سلول های حاوی زرده کمتر و کوچکتر موفق تر است.
انجماد اسپرم بخوبی در بسیاری از گونه های ماهیان اما فقط در تعداد محدودی از صدفها سالها پیش انجام شده است. هنوز مطالعات کمتری در جنین ماهیان و صدفها انجام شده است و مطالعات، بیشتر برروی گونه هایی باارزش تجاری و در معرض خطر انقراض صورت گرفته است . بیشتر فعالیت انجماد برروی اسپرم می باشد و علت آن شرایط ساختاری و فیزیولوژیکی پیچیده تر تخمک نسبت به اسپرم می باشد و ما در این مقاله بیشتر بر روی روشهای انجماد اسپرم توضیح می دهیم.

در مجموع اهداف انجماد اسپرم به این شرح است:
الف)کمک به جلوگیری ار انقراض نسل گونه های در معرض خطر
ب) کمک به تکثیر گونه هائی که در شرایط طبیعی، همزمانی رسیدگی جنسی در آنها کمتر دیده می شود
ج) کمک به در اختیار بودن اسپرم برای تمام طول سال
د) کاهش اثرات استرس حمل و نقل بر مولدین نر و در نتیجه جلوگیری از کاهش کارآئی اسپرم در نتیجه این حمل و نقل
ه) و هدف مهم تر، تهیه بانک اسپرم بصورت بانک ژنی برای نگهداری اسپرم ها حتی پس از مرگ جانور. این روش همچنین بعنوان راهکاری موثر برای ذخیره اسپرم گونه های در معرض خطر مثلا با شیوع بیماری ناگهانی و در نتیجه از بین رفتن گونه و یا با هر گونه از بی نظمی های معمول و یا حوادث ناگهانی مثل نشت نفت و روغن می باشد که یک منبع پایدار از اسپرم را تهیه می کند
و) همچنین جلوگیری از تلاقی خویشاوندی و ایجاد تنوع زیستی
اما باید دانست که بیشتر انجماد اسپرم، برای تک جنسی ها و مولدین استفاده می شود .
بسیاری از سلول های منجمد شده در دماهای بالای80 - درجه برای مدت زمان طولانی پایدار نیستند و پایداری سلولها برای مدت زمان طولانی نیاز به ذخیره آنها در دماهای زیر 130- درجه دارد تا از بقاء آنها اطمینان حاصل گردد.

روشهای انجماد اسپرم:

روشهای انجماد اسپرم به 2 صورت می باشد:

روشهای کوتاه مدت در انجماد اسپرم به روش های زیر میسر می باشد:
1) نگهداری در یخچال های معمولی (معمولا دمای 4 درجه سانتی گراد) تا 70 ساعت
2) استفاده از تغییر فشار اسمزی مثلا با قرار دادن اسپرم در محلول های نمکی
3) استفاده از محلول مشتمل بر پتاسیم
4) پائین آوردن درجه حرارت و سرد کردن البته ضمن استفاده از اکسیژن
5) کاربرد آنتی بیوتیک ها
6) استفاده از محلول های رقیق کننده ای مانند مخلوط اوره و کلرور سدیم
که این روش ها در واقع تحرک اسپرم ها را محدود می سازد.

_ روش بلند مدت در انجماد اسپرم:
در این روش می توان اسپرم ها را حتی تا 2 سال هم نگهداری کرد. روش کار به این شکل است که ابتدا اسپرم ها را با محیط های مختلف رقیق کننده چون دی متیل سولفوکساید((DMSO مخلوط کرده که این مواد بعنوان مواد محافظ سرما در ازت مایع عمل می کنند و سبب انجماد سریع اسپرم ها می گردد و در نهایت این اسپرم های منجمد را در ازت مایع با دمای 196- درجه سانتی گراد بطور سالم نگهداری می کنند. لازم به ذکر است که در مورد محافظ سرمائی، مسمومیت کم و قابلیت حل شدگی بالا حائز اهمیت است در صورت مسمومیت این محافظ ها، مرگ و میر در گامت ها بعد از انجماد زدائی اتفاق می افتد.
اما سرد کردن با نیتروژن مایع برای انجماد جنین روش قابل اعتمادی نمی باشد. و این روش را در زمینه انجماد اسپرم باید برای تمام انواع گونه ها آزمایش کرد زیرا گونه ها شامل انواع مختلفی از سلولها هستند که این سلول ها، گونه ها را با هم متفاوت می سازد پس انجماد آنها با هم متفاوت است.

باید عنوان کرد که صدمات زیادی هم در ارتباط با انجماد و انجمادزدائی می تواند صورت بگیرد و بسیاری از این صدمات در محدوده دمائی 0 تا 40- درجه اتفاق می افتد و دلیل این صدمات برداشت حرارت و ایجاد شوک سرمائی و تشکیل کریستال یخی و نیز بکار بردن محافظ های سرمائی در سلول ها و سمیت آنها و همچنین نوسان pH که در نتیجه انجماد و یا اضافه کردن محافظ های سرمائی اتفاق می افتد که باید به این مساله توجه کافی داشت و تا حد ممکن از این صدمات به روش های مختلف جلوگیری کرد.

اما هنگام استفاده از این اسپرم های منجمد شده با استفاده از قرار دادن ظروف محتوی آنها در آب تقریبا گرم در مدت زمانی کوتاه این اسپرم ها را ذوب کرده و در زمان ذوب شدن این اسپرم ها هیچ حرکتی ندارند و فرقی با اسپرم تازه ندارند و باید سریع استفاده شوند.
این خلاصه ای از روشهای انجماد اسپرم می باشد که هنوز هم به مطالعات زیادی در این زمینه نیاز می باشد و اعتقاد بر این است که با انجام اصلاحات لازم در این تکنیک ها می توان میزان بقاء را در این سلولها بمیزان بیشتری افزایش داد.