تعیین مرحله ی رسیدگی جنسی ماهیان خاویاری ماده برای تکثیر مصنوعی: ارزیابی رسیدگی تخمک

تعیین مرحله ی رسیدگی جنسی ماهیان خاویاری ماده برای تکثیر مصنوعی: ارزیابی رسیدگی تخمک

فرانک ای. چاپمن و ژوئل پی. ون ایننام

مترجم: سید مرتضی ابراهیم زاده-کارشناس ارشد شیلات

مقدمه

شاخص قطبی شدن تخمک یا PI نشانه ی خیلی خوب برای تعیین آمادگی ماهی ماده برای تخم ریزی می باشد، اما خود این شاخص نمی تواند مستقیما تعیین کننده ی کیفیت تخمک ها باشد. آزمون های زیست شناختی یا ارزیابی رسیدگی تخمک ها در زمانیکه در مرحله ی رسیدگی نهایی قرار دارند، قابل اجراست و احتمالاً [در این هنگام] به تزریق هورمون پاسخ می دهند. تخمک های نارس ممکن است وادار به تخمک گذاری (اوولاسیون) شوند اما تا زمانیکه به رسیدگی نهایی نرسند، قادر به لقاح موفقیت آمیز نخواهند بود. توانایی تخمک ها برای انجام رسیدگی نهایی، تحت تاثیر منفی پاسخ های فیزیولوژیکی یا متابولیکی جاندار به شرایط محیطی یا پرورشی نامساعد از قبیل تغییرات ناگهانی دما و دستکاری ناهنجار یا متناوب [مولدین] می باشد. تخمک ها ممکن است فوق رسیده و دچار فساد و دژنره شدن یا باز جذب مواد مغذی زرده (آتریزه)، شوند. تخمک های فوق رسیده اغلب با لقاح پایین یا درصد بالا بدشکلی (deformities) جنین و لارو و زنده مانی پایین همبستگی دارند.

مبانی

در طول دوره ی ذخیره ی زرده، تخمک های ماهیان خاویاری در مرحله ی توقف تقسیم سلولی و هسته (یعنی تقسیم میوز یا کاهشی متوقف شده است) قرار و حالت نارس دارند؛ گرچه ممکن است ماهیان ماده دارای تخمک های سیاه باشند. نزدیک به زمان تخمک گذاری (اوولاسیون)، زمانیکه ماهیان ماده آماده ی تخم ریزی     می باشند، تخمک ها به یک اندازه ی خاص مختص به گونه ی خود می رسند و آماده از سرگیری تقسیم میوز و ورود به مرحله ی نهایی رسیدگی می باشند. در طول مراحل رسیدگی نهایی تخمک، هسته یا ژرمینال وزیکول (GV) شروع به مهاجرت به سمت کناره تخمک،که در آنجا ژرمینال وزیکول (هسته) شکسته (GVBD) می شود، می کند. رسیدگی نهایی تخمک با رسیدگی سیتوپلاسمیک همراه است که آشکارا در ذرات زرده تفکیک و قطبی شده با اندازه ی های مختلف در سیتوپلاسم قابل مشاهده است. با وقوع شکست غشاء هسته، تخمک ها از فولیکول رها یا اووله می شوند. تخمک های رها شده را اووم (Ovum) می گویند و مواد وراثتی ماهی ماده، واقع شده در هسته ی شکسته شده ی تخمک، با ورود اسپرم بارور به داخل سیتوپلاسم تخمک، می تواند با مواد وراثتی ماهی نر ترکیب شود.  

فرایند رسیدگی نهایی تخمک تحت کنترل مواد القاء کننده ی رسیدگی یا MIS می باشد. در بسیاری از حیوانات از جمله ماهیان خاویاری، پروژسترون و مواد مشتق شده از آن بیشترین پتانسیل برای القاء رسیدگی نهایی تخمک را دارا می باشند. فرایند رسیدگی نهایی تخمک و شکست غشاء هسته بطور مصنوعی از طریق انکوباسیون تخمک ها در محلول پروژسترون در خارج از بدن ماهی قابل اجراست.

تولیدمثل موفق و زیست پذیری و قابلیت ادامه حیات تخمک ابتداً به اندازه، PI، و مرحله ی رسیدگی تخمک بستگی دارد. نمونه تخمک ها در اندازه ی مناسب (یعنی، قطر مشخص تخمک با توجه به نوع گونه)، PI پایین (کمتر از 10/0)، قطبی شدن قابل تمایز زرده، و شکست 100 درصدی غشاء هسته شاخص های قابل اطمینان برای تعیین میزان آمادگی ماهیان خاویاری ماده برای تخم ریزی و تولید تخمک های قابل زیست می باشند.

موادها

•    برای دستکاری  و حمل و نقل: تور لوله ایی، برانکارد و نیمکت، منبع آب شیرین.

•    برای بیوپسی غدد جنسی: دستکش جراحی، کاتتر یا لوله قابل انعطاف حداقل با قطر داخلی 4 میلی متر یا تراکر (Trocar) تغییر یافته، اسکالپل دسته شماره 3، چاقوی جراحی با تیغ شماره 10 یا 15، فورسپس بافتی آدسون- براون با 7×7 دندانه، سوزن نگهدارنده ی اُلسن- هگر، بخیه های قابل جذب، محلول 1 درصد ید، پاک کننده ی استریل، الکل یا ید برای پاک کردن و استریل وسایل در فاصله ی بین نمونه گیری، و ظروف کوچک نوک دار برای تیغه ها و سوزن بخیه ی مستعمل.

•    برای نمونه گیری تخمک: ویال های 25 میلی لیتری یا لوله سانتریفوژ یا فلاسک کشت بافت، محیط کشت (مانند محلول رینگر یا لی بوویتز ، در بطری پلاستیکی یک لیتری)، دو سرد کننده ی حاوی ژل یا یخ مرطوب، برای نگهداری محیط کشت و برای انتقال ظروف حاوی تخمک در دمای 14-18 درجه سانتی گراد، ترازو و لوازم توزین مواد شیمیایی (NaCl، 5/6 گرم، NaHCO3، 2 گرم، CaCl2، 300 گرم، و KCl، 250 میلی گرم) برای ساخت محلول رینگر که به یک لیتر آب مقطر یا آب یون برداری شده (دیونیزه) اضافه می شود.

•    برای آزمایش پروژسترون: پیپت های پلاستیکی قابل انتقال یکبار مصرف (برای جا به جایی و انتقال تخمک ها)، بشر شیشه ایی 20 میلی لیتری، ظرف یا لوله کشت بافت (مانند، پلت های مولتی وِل، پتری دیش 15-100 میلی متری، بشر 20 میلی لیتری، یا فلاسک های 50 میلی لیتری)، محلول استوک پروژسترون با غلظت 1 میلی گرم پروژسترون/ 1 میلی لیتر ETOH: وزن 10 میلی گرم پروژسترون (سیگما P-8783) و حل کردن در 10 میلی لیتر الکل اتانول/ اتیل الکل (مطلق یا 95 درصد)؛ قابل ذخیره برای 6 ماه، یا استفاده از پروژسترون قابل حل در آب (سیگما P-7556، تقریباً 70 میلی گرم در گرم)، انکوباتور سرد کننده، و دماسنج با قابل قرائت از بیرون.

•    برای تجزیه و تحلیل آزمایش: پیپیت های پلاستیکی قابل جا به جایی یکبار مصرف (برای جا به جایی و انتقال تخمک ها)، بشرهای 20 میلی لیتر، سنگ جوش (Boiling stone)، فویل آلمینیوم، صفحه ی فلزی داغ، دستکش بلند اون، ویال های پلاستیکی 25 میلی لیتری، ثابت کننده ی فرمالین 10 درصد (9 قسمت آب:1 قسمت فرمالدئید)، وسایلی برای جا به جایی و برش تخمک ها: فورسپس نازک ادسون- براون، تیغ ریش تراشی دو لبه، سطح برش (کف پتری دیش)، سینی یا ظرف یخ، ذره بین.

•    مواد متفرقه: کاغذ یا دفترچه ثبت اطلاعات، مداد و خودکار، دستکش برای مصارف معمولی، پاک کننده ها، و دستمال کاغذی.

دستورالعمل

مولدین ماده در ماه مورد نظر و پیش بینی شده برای تخم ریزی (به مقاله آبزی پروری ماهیان خاویاری: تکنیک های ویژه: شاخص قطبی شدن تخمک یا PI مراجعه کنید) نمونه برداری می شوند. تخمک های نمونه برداری شده برای تعیین شاخص PI مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند و همچنین قابلیت شکست غشاء هسته (GVBD) در پروژسترون آزمایش می شود. رسیدگی تخمک در محیط آزمایشگاهی در محلول رینگر تغییر یافته در دمای 16 درجه سانتی گراد برای 16 ساعت انجام می گیرد. 15 تا 20 تخمک در 5 میکروگرم در میلی لیتر پروژسترون و محیط شاهد انکوباسیون می شوند. بعد از انکوباسیون، تخمک ها جوشانده شده، روی یخ مرطوب سرد شده، در فرمالین بافر 10 درصد فیکس شده، برش داده و برای تعیین GVBD مورد بررسی قرار می گیرند.

1-    15 میلی لیتر محلول رینگر به هر پتری دیش یا ارلن مایر تمیز اضافه کنید یا بسته به اندازه ی ظرف انکوباسیون مقدار آن تعدیل گردد (2،3 یا چند برابر) (نیاز است تخمک ها با محلول پوشانده شوند). دو ظرف برای هر ماهی مولد ماده (ظرف شاهد و ظرف برای تیمار پروژسترون) فراهم گردد. بر روی ظروف برچسب C (گروه شاهد) یا P (پروژسترون) زده شود، و اگر آزمایش بر روی چندین مولد ماده در یک زمان انجام می گیرد، شماره متمایز کننده ی مولدین را نیز شامل شود.

2-    15 تخمک را به بشر 20 میلی لیتری با استفاده از یک پیپت پلاستیکی یکبار مصرف (استفاده نشده) انتقال دهید. به دقت تمام محلولی که به واسطه ی انتقال تخمک ها به داخل بشر ریخته شده بودند را با جاری ساختن یا با پیپیت جدا سازید. سپس، در حدود 5 میلی لیتر محلول رینگر از پتری دیش یا فلاسک به تخمک ها اضافه کرده و به آرامی بشر را تکان دهید و بعد تخمک ها و محیط کشت به داخل ظروف آزمایش ریخته شوند (این مرحله به خاطر حفظ حجم درست محلول رینگر در هر پتری دیش یا فلاسک مهم می باشد).

3-    75 میکرولیتر (075/0 میلی لیتر) از محلول ذخیره پروژسترون (با غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر) با یک میکروپیپت یا سرنگ 1 سی سی به ظروف با برچسب پروژسترون اضافه کنید (یا با توجه به مقدار محلولی که تخمک ها داخل آن قرار دارند تعدیل شود). به ظروف شاهد (کنترل) باید به همان مقدار (75 میکرولیتر) از مواد محلولی که برای حل پروژسترون استفاده شد (اتانل 95 درصد) اضافه شود. برای جلوگیری از هر آلودگی، از سرنگ های مجزا برای تیمار آزمایشی پروژسترون و گروه شاهد  استفاده شود، و اگر از میکروپیپت استفاده شده است، نوک آن تعویض گردد. به آرامی دیش ها یا فلاسک ها برای مخلوط شدن محلول ها تکان داده شوند. باید از آلوده شدن گروه های شاهد با پروژسترون به شدت مراقبت شود، چون حتی مقدار خیلی کم پروژسترون سبب وقوع GVBD در گروه شاهد می شود. ظروف شاهد را روی قفسه های انکوباتورهای با دمای کنترل شده که دقت آن   C۫  5/0± است، انتقال دهید، و ظروف حاوی پروژسترون را روی کف قرار دهید تا از هر نوع ریزش احتمالی از بالا به پایین قفسه که ممکن است بر نتایج شما اثر بگذارد جلوگیری شود.

4-    زمان را ثبت نموده و انکوباسیون برای 16 ساعت در دمای 16 درجه سانتی گراد انجام گیرد. اگر آزمایش ها در 4 بعد از ظهر تنظیم شده باشد ساعت 8 صبح فردا به اتمام خواهد رسید. مطمئن شوید که قفسه انکوباتور در دمای 5/0±16 درجه سانتی گراد تنظیم شده باشد. این دما باید یک هفته قبل از زمان نمونه گیری تنظیم گردد.

5-    زمانیکه انکوباسیون تمام شد، با استفاده از پیپت ها (یکی برای گروه کنترل و یکی برای ظروف حاوی پروژسترون) تخمک ها را به بشر 20 میلی لیتری که با شماره مولدین ماده و C (گروه شاهد) یا P (پروژسترون) برچسب دار شده اند، انتقال دهید. به هر بشر محلول ذخیره رینگر برای رسیدن به حجم کل 15 میلی لیتر اضافه کنید و به آرامی برای 3-5 دقیقه بجوشانید. یک حجم برابر در تمام بشرها، جوش خوردن تمام تخمک ها را به یک میزان تضمین می کند. سنگ جوش به هر بشر اضافه کنید و آنها را با یک ورقه فویل آلمینیومی بپوشانید، چون تخمک ها گاهی در حین عمل جوشیدن از بشر به بیرون پرتاب می شوند.

6-    بلافاصله با قرار دادن بشرها روی یخ خرد شده برای 15-30 دقیقه تخمک ها را سرد کنید.

7-    در این زمان تخمک ها با یک تیغ ریش تراشی برش داده شده و مورد ارزیابی قرار می گیرند. اگرچه، قرار دادن تخمک ها در فرمالین بافر 10 درصد حداقل برای 30 دقیقه یا به مدت یک شب بریدن تخمک ها را آسان تر می کند. مولدین خیلی رسیده معمولاً تخمک های نرمی دارند، حتی بعد از سرد شدن، اما این تخمک ها بعد از ذخیره سازی در فرمالین بافر سفت تر شده و برش آنها آسان تر می گردد.

8-    برش هر تخمک در امتداد محور قطب حیوانی- رویشی انجام می گیرد؛ معمولاً از طریق شکل بیضی تخمک ها ی تازه جمع آوری شده تشخیص داده می شود. دو نیمه ی برش داده شده را به سمت بالا بگیرید، و وجود یا عدم وجود وزیکول ژرمینال (GVBD) را از طریق تمرکز تابانیدن نور بر روی سطح برش مشاهده نمایید. برای هر تخمک شکسته شدن غشاء هسته یا سالم بودن آنرا ثبت نمایید. تخمک های محلول های شاهد و پروژسترون می بایست مورد آزمایش قرار گیرند، روی شکل و اندازه وزیکول ژرمینال و اینکه آیا به نوک قطب حیوانی مهاجرت نموده توجه کنید. اگر مطمئن نیستید به درستی تخمک ها را برش داده اید، دو نیمه از تخمک ها را گرفته و دوباره آنها را برش دهید (به یک چهارم)؛ مطمئناً وزیکول ژرمینال در این حالت قابل مشاهده خواهد بود.

9-    با محاسبه ی درصد تخمک هایی که شکست غشاء هسته در آنها اتفاق افتاده در گروه شاهد و تیمارهای محلول پروژسترون، نتایج را بررسی کنید. پاسخ 100 درصد در محلول پروژسترون و پاسخ برخی از تخمک ها در محلول شاهد نشان می دهد که مولدین ماده می بایست در ظرف یک هفته  تخم ریزی نمایند. پاسخ 100 درصدی تیمارهای پروژسترون و عدم پاسخ گروه های شاهد نشان دهنده ی اینست که احتمالاً این ماهیان در حدود 2 هفته دیگر تخم ریزی خواهند داشت. پاسخ کمتر از 100 درصد تیمارهای پروژسترون نشان می دهد که شما باید در حدود 3-4 هفته ی دیگر دوباره نمونه برداری انجام دهید. این فاصله ی زمانی در شرایطی است که مولدین در دمای 13-15 درجه سانتی گراد نگهداری شوند. در دمای پایین تر، این زمان ممکن است کمی طولانی تر شود و در دمای بالاتر این زمان کاهش می یابد.