کنترل تولید مثل در ماهیان استخوانی از طریق هورمون آزاد کننده ی گنادوتروپین GnRH
مقدمه
به منظور توسعه ی آبزی پروری در آینده مدیریت تکثیر آبزیان ضروری است. پرورش بسیاری از ماهیان باله دار هنوز متکی بر صید تخم یا لارو آنها از محیط طبیعی می باشد. به منظور ادامه ی رشد بخش آبزی پروری ، مدیریت تولید سلول های جنسی در محیط پرورشی ضروری می باشد.
علاوه بر این، مزارع پرورشی برای تامین بچه ماهیان لازم برای پرورش در طول سال ، که به معنای ادامه ی تولید سلول های جنسی از مولدین می باشد، نیاز دارند. گام مهم بعدی برای تکثیر ماهی برای مطلوب کردن مدیریت و فن آوری پروش مولدین، همزمان سازی استحصال سلول های جنسی از جنس نر و ماده می باشد. این عمل باعث کاهش هزینه، ساده کردن جمع آوری سلول های جنسی و انکوباسیون تخم ها می گردد.
متاسفانه، حتی اگر بسیاری از گونه های ماهیان باله دار را بتوان اهلی نمود ولی چندین مشکل در زمینه ی تکثیر این ماهیان وجود دارد که نیاز به دخالت پرورش دهنده می باشد. در واقع، مولدین، مخصوصا، به شرایط پرورشی حساس بوده و در فرایند فیزیولوژیکی تولیدمثل آنها در سطوح مختلف نارسایی دیده می شود.
فقدان محرک های محیطی و وجود استرس های پرورشی اجتناب ناپذیر ، اغلب سبب عدم رسیدگی نهایی اووسیت(FOM) ، اوولاسیون و تخم ریزی طبیعی در ماهی ماده و کاهش حجم مایع منی و نزول کیفیت آن در ماهی نر می شود. کاهش مقدار کل اسپرم فاکتور محدود کننده در بسیاری از مراکز تکثیر می باشد.که در این زمینه جمع آوری و ذخیره ی اسپرم بدون دستکاری های بعدی و بدون وابستگی به فصل خاص می تواند در امر تکثیر و ایجاد ماهیان دورگه مؤثر باشد.
پرورش دهنده ها می توانند در چندین مرحله برای فائق آمدن بر مشکلات ناشی از نارسایی در تکثیر ماهیان باله دار دخالت نمایند و به اصلاح کیفیت و کمیت سلول های جنسی بپردازند:
تغییر شرایط محیطی قابل تغییر( مانند دمای آب ، شوری آب، دوره ی نوری و شدت نور) شیه به شرایط طبیعی،تغییر حجم و عمق حوضچه، قرار دادن گیاه در داخل حوضچه یا از طریق رژیم غذایی ، استفاده از علم ژنتیک و یا بکار بردن موادی که بر روی سیستم غدد درون ریز تاثیر بگذارد، از جمله ی این دخالت ها می باشد.استفاده از این مواد راه حل مناسبی برای چیره شدن بر موانع تکثیر گونه های پرورشی می باشد.
چرخه ی تولید مثلی در ماهیان باله دار
سیستم کنترل غدد درون ریز تولیدمثل در ماهیان باله دار بر اساس محور هیپوتالاموس – هیپوفیز- غدد جنسی، مشابه ی پستانداران، می باشد. هیپوتالاموس عامل آزاد کننده ی گنادوتروپین (GnRH) که بر هیپوفیز تاثیر می گذارد ،را تولید می نماید. این غده سنتز و رهاسازی هورمون های گنادوتروپین (GtHs) که نقش آن سوق دادن غدد جنسی(تخمدان و بیضه) به سمت تولید سلول های جنسی می باشد، را کنترل می کند.علاوه بر این هیپوتالاموس، دوپامین که نقش بازدارندگی در این فرآیند را داراست، نیز تولید می کند.
دو نوع GtH که دارای ساختار و نقش شیمیایی متفاوت می باشند در ماهیان استخوانی تشخیص داده شده است: GtH I (یا FSH)، در مراحل آغازین گامتوژنزیس(ویتلوژنزیس و اسپرماتوژنزیس) نقش دارد و GtH II (یا LH ) رسیدگی نهایی اووسیت(FOM)، اسپرمیوژنزیس و اسپرمیشن را تنظیم می نماید. GtH II پلاسما درست قبل از اسپرمیشن و رسیدگی نهایی اووسیت افزایش یافته و باعث تعویض تولیدات استروئیدوژنیک و آندروژنیک (تستوسترون،T ، و 11- کتو- تستوسترون ،11-KT ، در ماهیان نر و 17- بتا استرادیول و استرون در ماهیان ماده) با تولیدات پروژستونیک (مانند 17- آلفا- 20- بتا- دی هیدروکسی – 4 پروژن -3- وان و 17- هیدروکسی پروژسترون) به ترتیب در سلول های درون شبکه ای بیضه و سلول های لایه ی تک تخمدان می گردد. هورمون های پروژستونی سبب رسیدگی نهایی اووسیت در ماهی ماده و تنظیم اسپرمیشن در ماهی نر (تحریک تولید مایع منی و رسیدگی اسپرماتوزوآ) شده و بر روی رفتار جنسی تاثیر می گذارد.
بخش اعظم فرآیند جذب آب اسپرم وابسته به گنادوتروپین ها می باشد .این هورمون ها باعث اسپرمیشن شده و حجم اسپرم را افزایش می دهند. بسیاری از مشکلاتی که در زمینه ی تکثیر ماهیان باله دار مشاهده می شود(عدم انجام رسیدگی نهایی اووسیت، اوولاسیون، اسپرمیشن و یا رهاسازی خودانگیز سلول های جنسی) در نتیجه ی نقص در انتشار GtH II بوسیله ی هیپوفیز می باشد.
متاسفانه بسیاری از ماهیها در زمان پرورش در روند تولیدمثلی خود دچار نقصان می شوند. در مولدین ماده، تحت شرایط پرورشی، رسیدگی نهایی اووسیت(FOM) و به تبع آن تخمک گذاری(اوولاسیون) و تخم ریزی دیده نمی شود(Zohar, 1988, 1989a,b; Peter et al., 1993) در مولدین نر نیز تحت این شرایط حجم اسپرم (مایع منی و اسپرماتوزوآ) کاهش یافته و کیفیت نازلی پیدا می کند(Billard, 1986, 1989..). دستکاری عوامل محیطی مختلف از قبیل دما، دوره ی نوری، حوضچه ی پرورشی از لحاظ عمق و حجم، وجود مواد تحریک کننده مانند پوشش گیاهی و ... در بیشتر اوقات سبب بهبود و تسریع در تخم ریزی می گردد(Zohar, 1989a; Munro et al., 1990; Yaron, 1995..).
بهر حال، در برخی از مواقع تنها راه کنترل تولیدمثل در ماهیهای پرورشی استفاده از هورمون برای القاء تخم ریزی می باشد. روش های مختلفی برای استفاده ازهورمون در ماهیها تحت شرایط پرورشی مورد استفاده قرار گرفته است. نخستین روش بکار گرفته شده استفاده از هیپوفیز ماهی رسیده حاوی گنادوتروپین ، بود. امروزه از هورمون هایی که بطور مصنوعی تولید می گردند و توان بالایی در آزاد سازی هورمون آزادکننده ی گنادوتروپین(GnRH) دارند، استفاده می شود.
تیمار هورمونی مولدین
از دهه ی 1930 چندین منبع هورمونی برای القاء و تنظیم تولیدمثل ماهی مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور از عصاره ی هیپوفیز ماهی رسیده که غنی از GtH بود، استفاده شد .بهر حال، این تیمار هورمونی دارای چندین مشکل است:
هزینه و عدم دسترسی آسان به هیپوفیز، خطرپذیری بالا برای ماهی،‌ تغییرپذیری در کیفیت تولیدات، امکان تداخل هورمون بکار رفته شده با مسیر غدد درون ریز ماهی از جمله ی این مشکلات می باشد. علاوه بر این تنها بر ماهیانی مؤثر می باشد که قرابت فیلوژنیکی(تکاملی) با ماهی دهنده دارند. به این دلیل، GtH ها با گنادوتروپین جفت انسان(HCG) جایگزین گردید که در بازار در حد وسیع در دسترس قرار داشت و از لحاظ شیمیایی خالص تر بود و اثرگذاری بیشتری نیز داشت.
گام بعدی در تکثیر ماهی جایگزینی GtH یا HCG با هورمون آزاد کننده ی گنادوتروپین مشابه ی صناعی (GnRHa) بود. این هورمون موثرتر از فرم خالص شده ی طبیعی بود به این خاطر که نسبت به انزیم های تجزیه کننده مقاومت بیشتری نشان داده و پیوستگی بیشتری با گیرنده های غده ی هیپوفیز نشان می دهد.
استفاده از GnRHa باعث تحریک تولید و رهاسازی GtH از غده ی هیپوفیز می گردد. مزیت استفاده از GnRHa به جای HCG بخاطر اثرگذاری بیشتر این هورمون، حفاظت بیشتر از سلامتی ماهی(چون آنها در آزمایشگاه ساخته می شوند خطری از لحاظ انتقال عوامل بیماریزا احساس نمی شود) ، قیمت ارزان و دسترسی آسان می باشد.
از این گذشته چون این هورمون ها از پپتیدهای کوچک تشکیل می شوند تداخلی با سیستم ایمنی بدن ماهی ایجاد نکرده و باعث واکنش های آلرژیک یا مقاومت بعد از چند بار تکرار استفاده از هورمون نمی گردد. استفاده از GnRHa باعث چندین بار تخم ریزی در مولد ماده و طولانی شدن فصل تولیدمثل ماهی نر بدون کاهش کیفیت اسپرم می گردد.در حقیقت، GnRH احتمالا باعث تحریک هورمون های دیگر هیپوفیز که در چرخه ی تولیدمثلی دخیل اند مانند هورمون رشد(GH)، هورمون محرک تیروئید(TSH) و سوماتولاکتین می شود.
فعالیت GnRHa در بالاترین سطح مسیر غدد درون ریز سبب تحریک متعادلتر و یکپارچه تر پدیده های تولیدمثلی با سایر کارکردهای فیزیولوژیکی مرتبط با چرخه ی تولید مثلی می گردد. در برخی از ماهیان مانند کپور معمولی و گربه ماهی آمریکایی GnRHaبه همراه ضد دوپامین برای خنثی کردن اثر بازدارندگی دوپامین بر روی هیپوتالاموس استفاده می شود.
در طول ده سال گذشته ، سیستم های مختلف تزریق GnRHa در ماهیان باله دار پرورشی مورد استفاده قرار گرفت. اولین آزمایش ها همان تزریق GnRHa بود که هنوز نیز روش مرسوم القا نمودن تخم ریزی در بین ماهیان پرورشی است. اگرچه، بعد از یکبار تزریقGnRHa افزایش GtHII پلاسما محدود می باشد چون هورمون سریعا بوسیله ی آنزیم از بین رفته و از جریان خون بعد از 10- 23 دقیقه حذف می گردد. به این دلیل ، یک تزریق کافی نبوده و برای بدست آمدن نتیجه ی مطلوب دو یا چند بار تزریق نیاز می باشد. از این گذشته، تزریق باید در هنگام نزدیک شدن به رسیدگی جنسی انجام گیرد.
از این رو کنترل ماهی برای یافتن زمان دقیق تزریق ضروری است. در عوض در ماهیان نر ، یک تزریق GnRHa تنها برای چند روز نقش مثبتی در اسپرمیشن دارد. اگر مولدین ماده بطور همزمان به رسیدگی جنسی و تخم ریزی برسند( یا در یک زمان در فصل تولیدمثل) این تاثیر کوتاه مفید نخواهد بود. اگرچه، در مولدین ماده ای که سلول های جنسی شان چندین بار در سال به رسیدگی می رسد نیز به تولید اسپرم بیشتر و طولانی تری برای انجام عمل لقاح نیاز خواهد بود.
سیستم آزاد کننده ی GnRHa
پیشرفت های اخیر در فن اوری تولیدمثل موجب تولید سیستم آزاد کننده ی GnRHa گردید. این سیستم اجازه ی کنترل میزان هورمون وارد شده به داخل خون را در مدت چند روز تا چند هفته می دهد و همزمان می توان این مواد را برای چندین سال نگهداری نمود. از نقطه نظر شیمیایی، تولیدات جدید ترکیبی از GnRHaرقیق شده و یک جایگاهی که از لحاظ شیمیایی بی اثر است بوده و بعد از تزریق در بدن حل می شود، می باشد. ترکیباتی که به عنوان جایگاه می توان استفاده نمود عبارتند از :
کلسترول و سلولز، لاکتیک اسید و گلیکولیک اسید یا پلیمرهای دیمر اسیدهای چرب و سی بازیک اسید، یا اتیلن و وینیل استات (EVAc). میزان آزاد شدن GnRHa به آسانی بوسیله ی تغییر در وزن مولکولی پلیمر ها، درصد بار کردن جایگاه با هورمون، نوع(آب دوست یا آب گریز) و فرم (گوی شکل یا قرصی شکل) جایگاه قابل کنترل می باشد.
به نظر می رسد سیستم EVAc مناسب تر است چون به راحتی تهیه شده، اثرگذاری بیشتری داشته و قابل ذخیره کردن در دمای 20- درجه ی سانتیگراد می باشد. در این سیستم گوی های کوچک بصورت سوسپانسیون در مایع ،تزریق می گردد. تمام این سیستم های آزاد کننده بر محدودیت های تکنیکی و بیولوژیکی روش های قدیمی فائق می آید.
در ماهی نر کاشت GnRHa تولید مایع منی را افزایش داده و فصل تولیدمثلی را گسترش می دهد. هیچ کاهشی در تراکم، تحرک و میزان باروری سلول های جنسی نر بعد از تزریق مشاهده نشده، چون در این روش تنها باعث افزایش موقت GtHII ، که عهده دار افزایش مایع منی است، می شود. این پدیده را این گونه می توان تفسیر نمود که احتمالا GnRHa تزریق شده باعث جذب آب بیشتر لوله های اسپرمی میگردد. فشار هیدروستاتیکی زیاد درون بیضه ای باعث حرکت اسپرماتوزوآ از بیضه به لوله ی وابران شده و در نتیجه سبب افزایش مایع منی می گردد.
الیته در برخی از گونه ها مانند آزاد ماهی اقیانوس اطلس (Salmo salar) و باس دریایی اروپایی (Dicentrarchus labrax) مشاهده شده که افزایش حجم اسپرم در اثر افزایش تولید سلول های اسپرم بوده و تنها به خاطر فشار هیدروستاتیک نبوده است. قابلیت افزایش مایع منی در ارتباط با نوع سیستم آزاد کننده ی GnRHa استفاده شده می باشد.
در ماهیان ماده استفاده از GnRHa می تواند کیفیت و کمیت تولید تخم را بهبود بخشد. از این گذشته این هورمون در همزمان سازی رسیدگی مولدین ماده به منظور تخم کشی از تمام مولدین موثر است. بهر حال، اثرگذاری تزریق هورمون بر اساس نوع گونه ، نوع سیستم آزاد کننده ی بکار رفته شده، مرحله رسیدگی جنسی ماهی و شرایط محیطی متغیر می باشد.
سیستم آزاد کننده GnRHa بطور موفقیت آمیز برای تحریک رسیدگی جنسی و تخم ریزی حدود 40 گونه ی ماهیان باله دار ماده و حدود 20 گونه ی ماهی نر مورد استفاده قرار گرفته است. به عنوان مثال : باس راه راه (Morone saxatilis) ، باس سفید(M. chrysops)، باس دریایی اروپایی (Dicentrarchus labrax)، کپورماهیان(ماهی طلایی Carassius auratus ؛ کپور معمولی Cyprinus carpio ) ، آزاد ماهیان(ماهی اقیانوس اطلس Salmo salar ؛ قزل آلای رنگین کمان Oncorhynchus mykiss ؛ آزاد ماهی قرمز Oncorhynchus nerka ) و خانواده ی سیانیده ( خامه ماهیChanos chanos)